关于征求《水质 浮游植物的测定 显微镜计数法（征求意见稿）》的通知

关于征求《水质 浮游植物的测定 显微镜计数法(征求意见稿)》
等2项国家生态环境标准意见的通知　　为贯彻《中华人民共和国环境保护法》，规范生态环境监测工作，我部编制了《水质 浮游植物的测定 显微镜计数法》等2项国家生态环境标准征求意见稿。按照国家生态环境标准制修订工作规则要求，现公开征求意见(征求意见稿及编制说明，可登录我部网站“意见征集”栏目检索查阅)。
　　各有关单位和个人均可提出意见和建议。请将意见建议书面反馈我部，并注明联系人及联系方式，电子文档同时发送至联系人邮箱。征求意见截止时间为2021年4月23日。
　　联系人：生态环境部监测司曹宇
　　地址：北京市东城区东安门大街82号
　　邮编：100006
　　附件：1.水质 浮游植物的测定 显微镜计数法(征求意见稿)
　　2.《水质 浮游植物的测定 显微镜计数法(征求意见稿)》编制说明
　　3.水质7种苯氧羧酸类除草剂的测定 高效液相色谱法(征求意见稿)
　　4.《水质7种苯氧羧酸类除草剂的测定 高效液相色谱法(征求意见稿)》编制说明
　　生态环境部办公厅
　　2021年3月24日　　(此件社会公开)
　　水质 浮游植物的测定显微镜计数法
　　(意见征求稿)　　1 适用范围
　　本标准规定了测定水中浮游植物的显微镜计数法。
　　本标准适用于地表水中浮游植物的测定。
　　当使用0.1 ml计数框，样品浓缩50倍时，对角线方式方法检出限为 9.2×103 cells/L；行格方式方法检出限为3.0×103 cells/L；全片方式方法检出限为9.2×102 cells/L；随机视野
　　方式的方法检出限与观察的视野数、显微镜视野面积有关，按附录A计算。
　　2 规范性引用文件
　　本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
　　HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范
　　HJ 494 水质采样技术指导
　　3 术语和定义
　　下列术语和定义适用于本标准。
　　3.1
　　浮游植物 phytoplankton
　　在水中营浮游生活的藻类植物，通常浮游植物就是浮游藻类，包括原核的蓝藻门和其它各类真核藻类。
　　3.2
　　显微镜计数视野 microscope counting field
　　显微镜视野中一定面积的计数区域。
　　3.3
　　检出限 detection limit
　　在 99%概率下，样品中可被检测到的最低浮游植物密度。
　　4 方法原理
　　在显微镜下，对样品中的浮游植物进行人工分类和计数，计算单位体积样品中各种类浮游植物的细胞数量。
　　5 试剂和材料
　　除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水。
　　5.1 碘化钾(KI)。
　　5.2 碘(I2)。
　　5.3 甲醛溶液：ω(CH2O)=37%。
　　5.4 鲁哥氏液(Lugols solution)
　　称取 60 g 碘化钾(5.1)，溶于 1000 ml 水中，再加入 40 g 碘(5.2)，充分搅拌使其溶解，静置 24 h 以上。鲁哥氏液在室温避光条件下可保存 1 年。
　　6 仪器和设备
　　6.1 浮游生物网：25 号筛绢网，网孔直径为 0.064 mm，网呈圆锥形，网口套在铜环上，网底端有出水开关活塞。
　　6.2 采样瓶：30 ml 棕色玻璃广口瓶(具塞)。
　　6.3 显微镜：物镜 4×、10×、20×、40×，目镜 10×或 15×。
　　6.4 浓缩装置：筒形分液漏斗，1 L。
　　6.5 样品瓶：50 ml 的棕色玻璃广口瓶(具塞)。
　　6.6 超声波发生装置：工作频率 40 kHz。
　　6.7 微量移液器：100 μl。
　　6.8 藻类计数框：0.1ml、面积 20 mm×20 mm，框内划分横直各 10 行格，共 100 个小方
　　格。
　　6.9 盖玻片：面积 22 mm×22 mm，厚度小于 0.2 mm。
　　6.10 计数器。
　　6.11 显微镜物镜测微尺。
　　6.12 显微镜目镜测微尺。
　　6.13 一般实验室常用仪器和设备。
　　7 样品
　　7.1 样品的采集
　　7.1.1 定性样品
　　使用浮游生物网(6.1)采集定性样品。关闭浮游生物网底端出水开关活塞，在水面表层至0.5 m水深处(或根据研究需要确定的其他水深)，以20 cm/s——30 cm/s的速度缓慢做“∞”形往复拖动约 1 min——3 min；也可沿表层至 0.5 m 水深处缓慢拖动，滤过 1.5 m3——5.0 m3体积的水体。将浮游生物网(6.1)提出水面，水体自然通过网孔，待底部还剩少许水体(5 ml——10 ml)时，将底端出口伸入采样瓶(6.2)中，打开底端活塞收集定性样品。
　　7.1.2 定量样品
　　按照 HJ/T 91 和 HJ 494 的相关规定进行样品的采集。
　　一般采集不少于 500 ml 样品。当水体中的浮游植物密度小于 106 cells/L，采集不少于 1L 样品。
　　7.2 样品的保存
　　7.2.1 定性样品
　　定性样品在 4 ℃——10 ℃冷藏避光条件下可保存 36 h。高温环境下采集的定性样品在保存前需逐渐降温，避免温度变化过快对浮游植物细胞产生损伤。
　　7.2.2 定量样品
　　向每 1000 ml 定量样品中加入 15 ml 鲁哥氏液(5.4)。室温避光条件下可保存 3 周；1 ℃——5 ℃冷藏避光条件下可保存 12 个月。
　　样品在保存过程中，应每周检查鲁哥氏液的氧化程度，如果样品颜色变浅，则应向样品中补加适量鲁哥氏液，直到样品的颜色恢复为黄褐色。
　　若定量或定性样品含大量有机质、需储存 12 个月以上时，应加入甲醛溶液(5.3)固定，每 100 ml 样品加 4 ml 甲醛溶液(5.3)。
　　8 分析步骤
　　8.1 混匀样品
　　每次取样前，必须采用上下颠倒至少 100 次的方式充分混匀所采样品。
　　8.2 定性样品的分析
　　在显微镜(6.3)下观察定性样品(7.1.1)，鉴定浮游植物的种类，并建立清单，为定量分析做好准备。
　　根据调查的需要，确定需鉴定到的分类单位，一般情况下，鉴定到属即可。
　　8.3 定量样品的分析
　　8.3.1 调整浮游植物密度
　　8.3.1.1 样品浓缩
　　当定量样品(7.1.2)中的浮游植物细胞密度小于 107 cells/L 时，需要对样品进行浓缩。
　　样品中浮游植物细胞密度为 105 cells/L——106 cells/L 时，样品浓缩 50 倍；样品中浮游植物细胞密度为 106 cells/L——107 cells/L 时，样品浓缩 10 倍。最终使浓缩后加入计数框中的 0.1 ml样品约含有 500 个——10000 个浮游植物细胞。样品中浮游植物细胞密度的初步判断可参照显微镜计数(8.3.2)进行。
　　将全部定量样品摇匀倒入浓缩装置(6.4)中，静置 48 h。用细小虹吸管吸取清液置于烧杯中，直至浮游植物沉淀物体积约 20 ml。旋开浓缩装置(6.4)底部活塞，将浮游植物沉淀物放入 100 ml 量筒中。用少许清液冲洗浓缩装置(6.4)1——3 次，一并放入量筒中，再用清液定容至所需浓缩倍数的体积。为了减少浮游植物吸附在浓缩装置壁上，在静置过程中，
　　应适时轻敲浓缩装置器壁。
　　8.3.1.2 样品稀释
　　当定量样品(7.1.2)中的浮游植物细胞密度大于 108 cells/L 时，需要对样品进行稀释。
　　样品中浮游植物细胞密度为 108 cells/L——109 cells/L 时，样品稀释 10 倍；样品中浮游植物细胞密度大于 109 cells/L 时，样品稀释 100 倍。经稀释使加入计数框中的 0.1 ml 样品约含有500 个——10000 个浮游植物细胞。样品中浮游植物细胞密度的初步判断可参照显微镜计数(8.3.2)进行。
　　对于含有细胞聚集成团的浮游植物样品，当不满足以下两个条件中的任何一个时，稀释前需进行超声波处理：(1)群体中的浮游植物细胞个体较易被辨识，能够对群体中的细胞进行计数；(2)当群体中所含细胞数量与群体体积或长度有固定比例时，如空星藻、盘星藻、丝状藻等，可以将群体作为计数对象，依据比例得到浮游植物细胞数量。超声波处理具体步骤为：取混匀的 30 ml 定量样品于样品瓶(6.5)中，用超声波发生装置(6.6)处理约 10 min 后，在显微镜下进行观察，如仍存在大量未分散的细胞团，则需延长超声波处理时间，直至能够准确计数。
　　根据稀释倍数，选取相应体积的容量瓶，量取不少于 25 ml 混匀后的定量样品或经超声处理后的样品，用水定容至刻线。如要保存稀释后的样品，应注意补充鲁哥氏液，使稀释后样品中的鲁哥氏液浓度与稀释前一致。
　　8.3.2 显微镜计数
　　8.3.2.1 准备
　　将样品放至室温，用微量移液器(6.7)取 0.1 ml 混匀样品，注入藻类计数框(6.8)中，用盖玻片(6.9)将藻类计数框完全盖住，静置约 5 min 后，开始计数。藻类计数框内应无气泡，如有气泡应重新取样。
　　8.3.2.2 选取计数方式
　　根据 8.3.1 调整后的浮游植物的密度，选用合适的计数方式，使测定过程中浮游植物细胞的总计数量为 500 个——1500 个。表1为推荐选用的计数方式。　　8.3.2.3 计数
　　8.3.2.3.1 全片计数方式
　　在 40×物镜下，逐一观察藻类计数框中全部 100 个小方格，分类计数每个小方格内所有浮游植物细胞，并用计数器(6.10)记录下每行的分类计数结果。若藻细胞体积较大，可降低物镜倍数。
　　8.3.2.3.2 行格计数方式
　　在 40×物镜下，逐一观察藻类计数框中第 2、5、8 行，共 30 个小方格，分类计数每个小方格内所有浮游植物细胞，并用计数器(6.10)记录下每个小方格的分类计数结果。若藻细胞体积较大，可降低物镜倍数。
　　8.3.2.3.3 对角线计数方式
　　在 40×物镜下，逐一观察位于藻类计数框对角线位置上的 10 个小方格，分类计数每个小方格内所有浮游植物细胞，并用计数器(6.10)记录下每个小方格的分类计数结果。若藻细胞体积较大，可降低物镜倍数。
　　8.3.2.3.4 随机视野方式
　　在 40×物镜下，随机抽取一定数量的视野，分类计数每个视野内所有浮游植物细胞，并记录下每个视野的分类计数结果。若藻细胞体积较大，可降低物镜倍数。计数前应测量显微镜视野面积，测量方法参见附录 B。
　　9 结果计算与表示
　　9.1 结果计算
　　样品中浮游植物细胞密度(cells/L)，按照公式(1)进行计算：　　9.2 结果表示
　　测定结果以科学计数法表示，保留 2 位有效数字。
　　10 精密度
　　6家实验室分别用全片计数、行格计数、对角线计数和随机视野计数对浮游植物密度为1×107 cells/L、3×107 cells/L、5×107 cells/L、1×108 cells/L 的实际样品进行了7次重复测定，实验室内的相对标准偏差分别为2.4%——11%，2.9%——10%，2.7%——11%，4.8%——8.2%；实验室间相对标准偏差分别为22%、5.6%、7.1%、21%。计算测定结果对数值的 95%置信区间，再取反对数得到的实验室间95%置信区间见表2。　　11 质量保证和质量控制
　　11.1 浮游植物均匀性
　　在开始显微镜计数前，应确认浮游植物在计数框中分布的均匀性。使用低倍数物镜观察浮游植物在整个计数框中的分布情况，若分布不均匀，应重新取样。
　　11.2 最少计数量
　　在单次测定中，浮游植物细胞计数总量不少于500个。当发现测定精度难以达到要求时，可适当增加每次测定中浮游植物细胞的计数总量。
　　11.3 精密度控制
　　每一样品测定两次。两次计数结果相对偏差应≤15%，否则应增加计数一次，直至某两次计数结果符合这一要求为止。测定结果为相对偏差≤15%的两次计数结果的平均值。
　　12 注意事项
　　12.1 如遇到一个浮游植物细胞的一部分在行格或视野内，而另一部分在行格或视野外，在行格上线或视野上半圈的细胞不计数，而在行格下线或视野下半圈的细胞计数。
　　12.2 计数过程中，如果发生样品水分蒸发，在计数框中形成气泡，则弃去本片重新取样计数。
　　原标题：关于征求《水质 浮游植物的测定 显微镜计数法（征求意见稿）》等2项国家生态环境标准意见的通知相关资料下载：附件1&2.pdf